Cre-ERT2小鼠是一類含有雌激素受體（estrogen receptor，ER）的配體結合區突變體（ERT）與Cre重組酶的融合蛋白表達的小鼠。Cre-ERT2在無Tamoxifen誘導的情況下，在細胞質內處於無活性狀態；當Tamoxifen誘導後，Tamoxifen的代謝產物4-OHT（雌激素類似物）與ERT結合，可使Cre-ERT2進核發揮Cre重組酶活性。

Tamoxifen給藥建議如下：

1. 他莫昔芬的配置和儲存
他莫昔芬不溶於水，一般建議用玉米油溶解：可按照20mg/ml的終濃度進行配置，37℃搖晃過夜。由於玉米油太多會導致他莫昔芬溶解度變差，所以建議一次配置50mL以內的他莫昔芬溶液，配置完成後分裝成1mL每管，-20℃避光保存，使用時避免反覆凍融，正常半年內都是可以使用的。此外，他莫昔芬對光敏感，在製備和儲存過程中需要注意避光處理。

他莫昔芬和玉米油的品牌較多，我們常用的如下，僅作參考：

Tamoxifen
(Sigma‐Aldrich)：CAS # 10540-29-1


玉米油 (Sigma‐Aldrich) CAS# 8001-30-7

2. 他莫昔芬的給藥劑量及頻次

對於成年小鼠（4周齡以上），他莫昔芬的推薦劑量為75mg/kg-120mg/kg。120mg/kg是我們現在使用比較普遍的一個劑量，一般注射3-5次（我們常用5次），隔天一次；75mg/kg是我們做過的最低劑量，但是給藥需要持續5次。幼鼠劑量可以降到100mg/kg。孕鼠及老齡鼠（大於6月齡）的劑量也需要適當減少。

3. 他莫昔芬的給藥方式

他莫昔芬可以通過腹腔注射、灌胃、飲食或飲水等途徑給藥，應用最廣泛的是腹腔注射給藥，腹腔注射的給藥劑量精準，便於控制。

腹腔注射給藥流程：正確抓取小鼠，將小鼠的鼻子朝向地面，露出腹部；定位動物的中線並將腹部分成四個象限，特別是動物的右下象限，是腹腔注射的合適位置（右下象限缺少重要的解剖結構）；多次腹腔注射時，應交替注射部位。

註：Tamoxifen會影響胎兒發育和生產，孕鼠誘導的時間儘量選擇孕晚期，並同時注射孕酮來減少流產概率。

灌胃給藥的給藥劑量和頻率與腹腔注射相同，在正式實驗前，建議同學們先反覆練習，熟練掌握灌胃給藥的技巧。

飲食/飲水給藥使用較少，主要是他莫昔芬水溶性差，小鼠的給藥劑量不好量化，且需要的誘導時間較長（一般需要幾周進行誘導），在誘導期間往往還伴隨着小鼠體重的下降（約10-15%）。

4. 注意事項

A. 他莫昔芬注射完成後不建議立刻開展實驗，一般來講，停藥後需要繼續飼養7天，再安排後續實驗。

B. 對照組小鼠需要同步進行不含他莫昔芬的玉米油溶液給藥。

C. 未處理的小鼠需要和注射他莫昔芬的小鼠分籠飼養，小鼠舐舔到他莫昔芬懸液，梳毛等行為可能導致意外敲除。

D. 加熱不會導致Tamoxifen失效，37℃過夜溶解他莫昔芬是沒有問題的。

最後，不同的實驗方案、不同的小鼠品系、不同的組織器官等對於給藥劑量、給藥頻率和給藥方式等的要求往往是不同的，因此，上述方法只是一個參考，面對具體實驗時，同學們還應根據參考文獻、實驗經驗先進行預實驗，以確定最佳方案。

參考文獻：Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 2009;530:343-63.  doi: 10.1007/978-1-59745-471-1_18. PMID: 19266339.

基因工程小鼠的命名規則

有沒有發現，當你在查詢或看paper時，往往會蹦出幾個賊長的，還夾雜着數字、上標、符號的名稱，比如：129-Trp53^tm1Holl/J、FVB-Tg(PomcCre)5Brn...... 看上去很複雜的樣子。這些其實是基因工程小鼠的全名。

如果把這一長串字符解構一下，常見的基因工程小鼠可以分為兩種命名方式：

• 基因定點修飾的小鼠命名，比如：敲除、敲入、點突變等等。

• 隨機轉基因的小鼠命名

基因定點修飾小鼠的命名

這一類小鼠的名稱基本長這樣：

下面我們對這些組成部分逐一說明~

品系背景

如果是在單一的小鼠背景上完成的基因修飾，並且在繁育過程中未引入其它品系，那麼就可以以品系全稱來表示。比如：

如果是在混合品系背景上，那麼可以用這幾個品系（<3個）縮寫，並以分號作為間隔。分號前表示受體，分號後表示供體。比如：在一個來自C57BL/6與129雜交 ES 細胞系上定點敲除某個基因，就可以用B6;129表示。直至這個品系與 C57BL/6 小鼠回交至近交系程度，那麼可以改寫為B6.129。

如果供體品系是混合背景或有未知來源，那麼回交至受體品系的近交系程度後，可以用.Cg來表示，比如：B6.Cg。

如果存在3個以上祖系或有未知來源的混合遺傳背景，那麼以STOCK來表示。

被修飾的基因

這裏的基因名用的是 Gene Symbol。Gene Symbol 和 Gene Name 到底有什麼區別呢？

Gene Symbol 有以下特點：

• 物種中唯一的

• 短，3-5個字母，最多不超過10個字母

• 只用羅馬字母和阿拉伯數字

• 大寫字母開頭，後跟小寫字母或數字

• 不包括組織特異性或分子量

• 最好跟 Gene Name 的首字母一致

• 斜體表示

• 不同物種的同源基因使用相同的 Gene Symbol

Gene Name 則一般有以下特點：

• 簡短，可以是幾個單詞，包含基因功能或特點

• 首字母小寫（人名或專有名詞除外）

• 使用美式拼寫方法

舉個例子你就明白啦，例如：

Shh 是 Gene Symbol，而 sonic hedgehog 則是它的 Gene Name。

所以，如果你想查找某個基因的敲除品系，那麼最好輸入 Gene Symbol，而不是 Gene Name 或者曾用名。

這裏特別提一下定點過表達的這類情況：

目前最常用的兩個定點過表達的整合位點，一個 Rosa26位點，一個是 H11位點。

• Rosa26是一個基因，所以可以用它的 Gene Symbol，也就是 Gt(ROSA)26Sor。

• H11並不是某一個特定基因，而是存在於兩個基因之間的一個特定染色體位置，所以沒有 Gene Symbol。目前公認的命名是 Igs2，表示 intergenic site 2 的縮寫。

修飾方式^（上標）

tm：對於 ES 細胞打靶途徑獲得品系，用 tm 表示 targeted mutation。

em ：對於 CRISPR/Cas9 或 TALEN 等核酸酶系統介導的基因修飾品系，用 em 表示 endonuclease-mediated mutation。

編號^（上標）

這裏的編號是指在該實驗室中，對該基因修飾的序列號。

例如：Trp53^tm1Holl表示在Holl實驗室對Trp53基因進行的第一次突變。

有時候會看到 tm1.1、tm1.2的情況，這是指條件性基因敲除（CKO）小鼠在與生殖系重組酶工具鼠交配後獲得的子代小鼠品系，為了與親代 CKO 小鼠（編號為 tm1）區分。而親代 CKO 小鼠與其它組織特異性重組酶工具鼠交配的子代就不單獨命名了。

插入結構^（上標）

對於基因敲除和條件性基因敲除，在命名中一般不加入插入結構的部分，即編號後緊跟實驗室代號。

例如：Trp53^tm1Holl。

如果有敲入的基因，可以在括號內寫出插入的外源基因。

例如：Cd19^{tm1(cre)Labcode}表示在 Cd19基因中敲入 Cre基因。

如果敲入的是 RNAi，那麼把RNAi針對的靶點寫進括號中。

例如： Gene^{tm#(RNAi:Il23a)Labcode} 。

實驗室代號^（上標）

一般實驗室代號是機構名稱的首字母縮寫。

比如：

J 表示 The Jackson Laboratory；

Kyo 代表 Kyoto University ；

Smoc 代表上海南方模式生物；等等。

隨機轉基因小鼠的命名

這一類小鼠的名稱基本長這樣，命名中Tg代表 Transgene。

轉入基因

在括號中填入轉入的基因的啟動子信息以及 Gene Symbol。

編號

指該實驗室製備的轉基因 founder 編號或系列編號。

如果使用轉座子系統來製備轉基因小鼠的話，那麼命名時在 Tg 後面加上 Tn，表示 transposable element。隨後的括號內，一般需要包括：所使用的轉座子系統縮寫，以及構建的載體結構，兩者用「-」連結：TgTn(transposon_class_abbreviation-vector)#Labcode。

例如：B6.Cg-TgTn(sb-lacZ,GFP)IF2Jtak/JtakRbrc，其中 sb 是 sleeping beauty的縮寫。

知道了基因工程小鼠的命名規則，你可能又要問了，名字這麼長總不能每次都寫全名吧？確實，通常在文章中對所用的基因工程小鼠進行表述時，我們可以採用簡寫的方式。具體可以怎麼寫呢？

基因工程小鼠的一般簡寫方式

基因敲除

大家很熟悉了，可以分別用加、減號上標來表示 wildtype allele 與 mutant allele：

• KO 純合子 Gene^-/-

• KO 雜合子 Gene^+/-

• 野生型對照 Gene^+/+ 或 WT (wildtype)

基因敲入

將敲入的元件寫在上標里，例如：

• Shh 基因 E177A 點突變雜合子：Shh^E177A/+

• 如果 Shh 基因敲入報告基因或Cre重組酶基因，可以寫成 Shh^EGFP/+，或者也可以直接寫成 Shh-EGFP、Shh-Cre。

轉基因

一般直接寫出表達的基因結構，例如：

• Villin promoter 驅動 EGFP 報告基因的轉基因小鼠就可以表示為 Vil-EGFP。

條件性基因敲除

將 flox 作為上標表示，比如：

• CKO 純合子 Gene^flox/flox 或 Gene^f/f

• CKO 雜合子 Gene^flox/+ 或 Gene^f/+

如果與廣泛表達 Cre 或生殖系表達 Cre 工具鼠交配後獲得了全身敲除的小鼠，那麼可以按 KO 小鼠的規則來簡寫。

如果與組織特異性 Cre 小鼠交配，那麼可以組合寫成：Gene^flox/flox；Cre。

如果文章中只用到一種組織特異性 Cre 工具鼠，也可以按 KO 的方式簡寫，即 Gene^-/- 可以表示 flox 純合子且 Cre 陽性小鼠。

如果有多種不同的 Cre，那麼就需要分別表示了。

例如：Tlr5 flox 小鼠分別與小腸上皮細胞（IEC）特異性 Cre（Vil-Cre）、 DC 細胞特異性 Cre（CD11c-Cre）交配的子代中發生基因敲除的純合子小鼠可以分別表示為 Tlr5^flox/flox；Vil-Cre 和 Tlr5^flox/flox；CD11c-Cre。如果覺得這樣寫太麻煩，也可以這樣表示：Tlr5^ΔIEC 和 Tlr5^ΔDC。

關於基因工程小鼠的命名原則大致先介紹到這裏，使用基因工程小鼠的過程中有任何問題，歡迎與我們溝通。

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一般可通過PCR+ 測序方法進行基因型鑑定。示意圖如下：

圖10. A. 野生型小鼠PCR 產物測序峰圖。B. 陽性F0 代小鼠基因型鑑定PCR 產物測序峰圖。CRISPR/Cas9 作用後，由於發生同源

重組修復(HR) 的同時，也可能發生非同源重組修復(NHEJ)。因此，切點附件可能出現雜峰現象。C. 陽性F1 代小鼠基因型鑑定PCR

產物測序峰圖。陽性F1 小鼠基因組一個拷貝是野生型，一個拷貝是突變體，在Cas9 作用位點附近區域測序，突變點位置有雙峰現

象（野生型和突變體，兩種基因型產生了兩種峰型）。C』 和C」 為C 圖測序PCR 產物連結T-vector 後，單克隆測序結果。其中，C』

為野生型，C」 為突變體。峰型對比可以發現C」 較C』 的目的突變點CCT 突變為GTT，C』 和C」 峰型結果可以和C 圖峰型結果相吻合。

對於NHEJ 隨機修復獲得的基因敲除小鼠，一般可通過PCR+ 測序方法進行基因型鑑定。示意圖如下：

圖9. A. 野生型小鼠PCR 產物測序峰圖。B. 陽性F0 代小鼠基因型鑑定PCR 產物測序峰圖。CRISPR/Cas9 作用後，由於發生NHEJ

隨機修復，產生多種基因型，在Cas9 切點附近出現雜峰現象。C. 陽性F1 代小鼠基因型鑑定PCR 產物測序峰圖。陽性F1 小鼠基因

組一個拷貝是野生型，一個拷貝是突變體，在Cas9 作用位點附近區域測序有後雙峰現象（兩種基因型產生了兩種峰型）。C』 和C」 為C. 圖

測序PCR 產物連接T-vector 後，單克隆測序結果。其中，C』 為野生型，C」 為突變體。峰型對比可以發現C」 較C』 缺失了兩個鹼基

CC。C』 和C」 峰型結果可以和C 圖峰型結果向吻合。

引物設計可參考以下圖示方案。

圖8. A. 鑑定Flox 小鼠中Neo 基於是否去除；B. 鑑定在特定組織中目的基因是否被敲除。

引物設計可參考以下圖示方案。

圖7. A. 基於ESC 打靶的三引物鑑定方案；B. 基於ESC 打靶的二引物鑑定方案；C. 基於CRISPR/Cas9 的鑑定方案。

在進行基因型鑑定PCR 時通常採用粗抽提的方法從鼠尾組織中提取基因組DNA，這類抽提方法獲得的基因組DNA 含

有較多雜質，可能會影響後續PCR 的效率。可以考慮優化抽提方法，保證基因組DNA 質量。在PCR 反應體系中，基

因組DNA 的濃度也會影響PCR 的效率。基因組DNA 過多或過少都有可能導致PCR 擴增失敗。可以考慮調整PCR 反

應體系。若PCR 鑑定出現非特異性條帶，可以考慮提高退火溫度，以提高引物的特異性結合。

基因工程小鼠基因型PCR 鑑定的基本原則是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組

DNA 為模板進行PCR，並以凝膠電泳比對比不同基因型特異產物的大小，根據條帶大小來區分小鼠的不同基因型。

研究表明小鼠模型中Cre 表達也會有毒副作用，例如不育和存活力降低。某些品系的Cre 純合子小鼠尤其是這樣。

Cre 活性過高可能引起在基因組中未知的loxP 位點重組，從而引發敲除或移位進而影響小鼠存活。另外，在通過顯微

注射獲得的Cre 轉基因品系中，Cre 基因插入可能干擾某些重要內源基因的功能。

已研究的大部分品系中，Cre 表達與從哪個親本遺傳的Cre 基因無關。但對某些品系而言，從母本遺傳Cre 基因的小

鼠相較於從父本獲得Cre 基因的小鼠，其Cre 重組效率更高，例如EIIa-Cre 品系。